第2章　药物相关基因检测技术

药物基因组学的高速发展为个体化给药提供了基础，而真正实现个体化给药，基因多态性检测成为关键环节。近年来，分子生物学以及新材料、新技术等的发展，高效的基因检测手段，如数字荧光分子杂交/原位杂交荧光染色脱氧核糖核酸测序技术、Taqman-MGB技术、双脱氧测序技术、焦磷酸测序技术等，已被广泛应用于临床药物相关基因检测中。同时，基因捕获和二代测序等高通量、高并行化和自动化的基因检测技术已开始广泛应用于药物基因组研究。

基于双脱氧核糖核酸末端终止（双脱氧测序、Sanger测序）的DNA序列测定是基因分型的最直接、最可靠的分型方法，一直以来被认为是基因分型的金标准。其原理是：以DNA单链为模板，利用DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，根据碱基互补配对原则，将4种脱氧核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）和经过不同颜色染料标记的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）加入到引物3’-OH末端并使引物链得到延伸或终止，最终得到长度不等的有荧光标记的DNA片段，然后经电泳分离和荧光激发检测DNA各片段末端碱基类型，进而读取完成DNA序列。

Sanger测序主要包括聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增、纯化、测序和分析4部分。通过测序不仅可以得到所在区域范围内所有基因信息，而且能发现一个SNP位点罕见的第三种（甚至第四种）基因型。该法的不足在于：只适用于定性研究，不能定量；灵敏度有限，当靶基因突变比例过低时，可能出现假阴性；对于仪器设备、试剂和实验空间有特殊要求，不适合一般实验室；操作复杂，基础成本较高，速度慢，通量低。

目前商业化的测序公司和检验中心为研究用DNA测序提供了平台，在待测样本和位点数较少的研究中，对所有样本的目的片段测序可能更为简便。但对于临床检测，鉴于医疗器械准入和设备成本的高昂，导致目前直接开展测序仍难以推广普及，需要构建更为经济、简单、准确、高效的检测技术和平台。

微测序法（minisequencing）又称为单核苷酸引物延伸法（single nucleotile primer extension，SnuPE）或单碱基延伸法（single base extension，SBE）。该技术是建立在测序反应引物延伸基础上的一种基因分型方法。其原理是位点特异性延伸引物与靶序列退火，引物3’端结束在SNP位点前一碱基处，加入标记的ddNTPs进行反应，开始延伸的第一个碱基就是多态性碱基。由于加入ddNTPs，反应进行一个核苷酸即停止，然后经引物延伸的荧光信号判断SNP基因型。

微测序根据介质不同分为液相微测序和固相微测序。

依其原理，首先是PCR扩增含SNP位点DNA片段，进而纯化，然后建立单碱基延伸反应，最后通过荧光信号采集进行基因分型。液相微测序基因分型的优点在于寡核苷酸序列较短，设计简单，而且该方法可以通过在SNP特异性微测序引物5’端添加不同重复次数的寡聚核苷酸尾，不同长度的延伸产物可通过毛细管测序仪鉴定，从而实现在同一反应中同时检测多个SNP位点，而多重微测序的应用也有效降低了实验成本。因为SBE反应中包括四种ddNTP，所以能准确检测两种以上等位基因的SNP位点的基因型。该法的不足在于实验需要PCR纯化，相对步骤烦琐，同时微测序技术不能用于小的插入和缺失多态性的基因分型。多重微测序仅能实现低水平多重性检测，不适用于高通量检测。该法技术要点：首先为保证单碱基延伸特异性，在微测序之前必须进行PCR产物纯化，以除去多余的PCR引物和dNTP，而多余的dNTP会使测序引物延伸多个碱基，干扰测序反应。用于微测序的DNA聚合酶应不具有3’-5’核酸外切酶活性，以防止发生引物3’-5’降解。

与液相微测序不同的是，固相微测序先将位点特异性基因分型寡核苷酸固定在微阵列基质上，然后把多重PCR产物杂交到阵列上，如果探针与PCR产物退火，PCR产物就作为单碱基延伸反应模板，延伸反应后，使用荧光扫描对掺入ddNTP的荧光进行测定，据此判断SNP基因型。

另外一种固相微测序是将待测模板固定为固相支持介质表面（通过生物素标记引物进行扩增，后与亲和素包被的固相介质结合，在经变性，洗脱不带标记的互补产物链，达到固定产物的目的），然后加入微测序反应体系进行微测序反应。

第三种固相微测序称为单碱基延伸-附加尾序列阵列（single base extension-Tags，SBE-TAGS）。该法是将引物设计成5’端为一段特异性序列尾（Tag），3’端为等位基因特异性序列，每个位点的引物具有独特的5’端尾序列，从而实现在同一反应体系中进行多重单碱基延伸，每个SNP位点的延伸产物通过5’端特异的尾序列识别固相支持介质上的互补序列并杂交，最后通过检测延伸碱基荧光信号来判断基因型。

焦磷酸技术（pyrosequencing）是一种基于单碱基延伸反应和化学发光原理对SNP进行分型检测的方法。与微测序不同，焦磷酸法测序可以在引物末端延伸几个核苷酸，通过酶级联生物发光反应测定焦磷酸盐而实现基因分型。测序引物与单链DNA模板退火后，在DNA聚合酶作用下，依次加入4种不同的dNTP，如果加入的碱基与模板上的引物末端对应的下一个碱基互补，则发生延伸反应，释放焦磷酸（pyrophosphoricacid，PPi），在三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一份dNTP的聚合与荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光信号的释放和强度，实现实时测定DNA序列的目的。

焦磷酸测序主要包括3个操作步骤：PCR、测序模板制备和测序反应。所需仪器包括PCR仪和焦磷酸测序仪。为了制备测序用单链模板，需要对其中一条引物进行修饰，如5’端生物素（biotin）标记等。测序用模板的制备通常有3种方法：磁珠固相法、琼脂糖微球固相法和酶解液相法。

焦磷酸测序是Sanger法的重要补充。该方法能够直接测定突变的类型和准确位置，检测灵敏度高，并且快速，可以实现高通量自动化精确检测，还可对突变进行定量测定，以及发现新的遗传变异和突变。其主要缺点是不能测定长的基因序列，对试剂和仪器有特殊要求，需要专用的焦磷酸测序仪，不利于方法的常规使用，另外有些基因序列（如HLA-B 1502和HLA-B 5801基因）用焦磷酸测序很难测准。

传统的杂交测序技术（sequencing by hybridization）是基于印迹杂交或核酸原位杂交途径，利用寡核苷酸探针与目标DNA杂交，其所携带的荧光基团会对DNA进行标记，识别特异序列，其特征是测序读长比较短。这一技术从20世纪90年代起出现，后来演变为芯片杂交测序技术。但以前进行杂交测序时只进行一次杂交，很难甄别非特异信号，因此可能由于一些非特异杂交而导致序列误读。国外学者一直试图从杂交信号的数学计算模型入手，提高测序的准确性。

由于测序探针是荧光素标记的，利用荧光检测设备，即可直接检测杂交染色的结果，从而完成目标序列的检测。采用数字荧光分子杂交技术，可高灵敏度地捕捉杂交测序的荧光信号变化，从而完成精确测序，由此形成了新一代的杂交测序技术，即数字荧光分子杂交/原位杂交荧光染色脱氧核糖核酸测序技术（简称“数字荧光分子杂交/杂交测序技术”）体系。

数字荧光分子杂交/杂交测序技术需要更多的模板核酸（通常不低于5000拷贝）才能完成测序，但不需要经过PCR环节。这一特点有独特的优势：①不怕污染：少量的异源DNA污染的信号很低，不会影响测序准确性，例如500个拷贝的异源DNA污染，在PCR扩增中绝对是灾难性的，但在杂交测序中，异源信号的强度不到总信号强度的10%，则可以作为本底信号而被消除；②简便：杂交测序不需要PCR扩增，因此在普通实验室即可开展，不需要PCR扩增实验室的强制认证；③简捷：杂交测序没有烦琐的标本DNA提取和PCR扩增产物提取环节，将临床标本简单处理即可进行杂交测序，因此测序速度非常快，从拿到临床标本算起，2～3小时即可报告测序结果。

等位基因特异性PCR（allele-specific PCR，AS-PCR）又称为扩增阻滞突变系统PCR（amplification refractory mutation system PCR，ARMS-PCR）。它建立在等位基因特异性延伸反应基础上，只有当某个等位基因特异性引物的3’末端碱基与突变位点处碱基互补时，才能进行延伸反应。常规PCR扩增DNA所用的上、下游引物与靶序列完全匹配，而等位基因PCR采用等位基因特异的两条上游引物，两者在3’端核苷酸不同，一个对野生型等位基因特异，另一个对突变型等位基因特异，在Taq DNA聚合酶作用下，与模板不完全匹配的上游引物将不能退火，不能生成PCR产物，而与模板匹配的引物体系则可扩增出产物，通过凝胶电泳就能很容易地分辨出扩增产物的有无，从而确定SNP基因型。

AS-PCR虽然简便、廉价、不需要昂贵的实验设备，但是该技术并未被广泛应用于SNP分型。原因在于理论上Taq DNA聚合酶必须在引物3’末端与模板完全互补情况下才能进行有效的聚合反应，但由于Taq DNA严谨性受多因素影响，某些情况下，即使引物的3’末端碱基与模板不互补，延伸仍然可以进行，而且不同的3’末端错配（mismatch）有不同的延伸效率，因而仅靠引物3’末端一个碱基的错配不能充分而可靠地区分两个等位基因，进而造成假阳性结果。而且，通常的AS-PCR为三引物两管体系，即两条外引物扩增包含SNP位点DNA片段作为阳性对照，在两体系中分别加入对应不同基因型的内引物，分别与对侧外引物特异性扩增，最后通过电泳观察是否有扩增产物，判断基因型。该方法需要分管进行，增加了实验成本和检测量，使得分型通量下降。

四引物扩增阻滞突变系统PCR（tetra-primer amplification refractory mutation system PCR，Tetra-primer ARMS-PCR）是在AS-PCR基础上发展起来的专门用于检测SNP的单管ARMS检测技术。该技术原理是同时使用4条PCR引物，两条3’末端位于SNP位点上的分属不同基因型的方向相反的内引物（inner primer），两条位于SNP外侧并与SNP距离不等的外引物（outer primer），4条引物理论上如果都匹配的话，两两组合可扩增出3条DNA产物（位于同一位点的两内引物无法产生长片段扩增产物，多为引物二聚体）。但若其中一条针对SNP的内引物不匹配，则只能扩增出另外两条DNA片段。由于外引物到达SNP距离不同，扩增产物大小也就不同。通过电泳根据扩增产物的大小即可判断基因型，同时由外侧引物扩增的长片段产物可作为体系的阳性质控。为了提高引物延伸的特异性，可在3’端倒数第2位或第3位碱基处引入一个错配碱基。该错配碱基与3’末端的错配碱基共同作用，使引物在与其3’末端不互补的模板中扩增产物率显著降低，而引物在与其3’末端互补的模板中正常扩增。引入的错配碱基类型取决于3’末端碱基错配类型。当3’末端是“强”错配（A/G或G/T）时，可以在引物中引入一个“弱”错配（C/A或G/T）；当3’末端是“弱”错配时，则需要在引物中引入一个“强”错配。当3’末端是“中度”错配（A/A、C/C、G/G或T/T）时，可以在引物中在引入一个“中度”错配。

四引物ARMS-PCR系统检测SNP一般通过5个步骤：SNP位点（即基因序列）查找、DNA样品制备、引物设计、PCR扩增、产物检测和结果判读。SNP位点序列查询和DNA样品制备在此不再赘述。引物设计是四引物ARMS-PCR成功与否的关键。

内引物设计原则：①每条引物的产物约为28个碱基；②每条引物中4种碱基的分布均衡；③3’末端碱基必须位于待测SNP位点处；④两条引物延伸的方向相反，两条引物分别与SNP位点两侧的基因序列互补；⑤每条引物的GC含量越接近50%越好；⑥引物3’端倒数第2位或第3位碱基处引入一个错配碱；⑦引物的Tm值越近越好，若由于GC含量过低或过高不能达到，尽量通过增减碱基完成，由此出现的高稳定性的发卡结构和二聚体，靠近5’端者可通过引入突变解发卡，而3’端考虑倒数2位或3位突变，同时要结合碱基错配突变原则；⑧引物设计完成，应进行Blast特异性检验。

外引物设计：①引物与模板的序列紧密互补，引物与引物之间避免形成稳定二聚体或发卡结构，引物不能在模板其他位点形成非特异扩增；②引物的长度一般为15～30bp，常用为18～27bp，但不应大于38bp；③引物序列GC含量一般为40%～60%，上、下引物的GC含量不应相差太大；④尽量避免3’末端碱基为A，因为Taq DNA聚合酶合成效率受3’末端碱基影响较大，末端碱基为A的错配率明显高于其他碱基；⑤避免形成引物二聚体和发卡结构；⑥Tm应尽量和内引物接近；⑦两条引物与SNP位点的距离差应足够大，以保证内外引物的扩增产物大小能被电泳完全区分；⑧引物设计完成应进行Blast特异性检验。

四引物ARMS-PCR是基于等位基因特异性扩增基础上的SNP分型方法，鉴于DNA聚合酶严谨性、引物识别效率等因素，要实现四引物ARMS-PCR准确扩增判断基因型，需要对反应体系进行严格、有效的优化。

四引物ARMS-PCR检测技术在特异引物3’末端引入错配碱基，从而提高扩增的特异性，降低了假阳性率，该方法实现了在一个管内同时检测3种基因型，可通过凝胶电泳检测分型，不需要大型仪器，具有快速、简便、成本低等优点，在一般实验室即可推广应用。但是，由于在同一反应体系里有4条引物，多个SNP位点难以在同一反应中实现检测分型，且不同SNP位点序列差异较大，导致退火温度有较大差异，多个SNP位点难以同时在一台PCR仪上完成PCR反应程序，所以该方法难以实现高通量检测。为了使两条等位基因特异性扩增，往往需要在DNA浓度、引物比例和退火温度等因素上进行多番优化，尤其在内引物设计方面，若初始设计引物在经过一系列优化后不能特异扩增，还需再次设计反向引物，所以该法优化时间长、自动化程度低，因此该法不适用于位点附近GC含量过高或过低的SNP的分型检测。

TaqMan技术是由PE公司于1995年开发的一种基于序列杂交反应原理的基因分型定量技术。该技术体系需要一对引物扩增包含SNP所在的序列，还需要一对等位基因特异性荧光共振能量转移探针，其5’端分别连有两种不同的荧光染料，3’端连有通用的荧光淬灭基团。一个完整的探针，淬灭基团和荧光基团在空间上特别靠近而产生荧光淬灭。正常情况下检测不到5’端荧光基团发出的荧光，只能检测到3’端淬灭基团的背景荧光。在靶基因扩增过程中，PCR引物和荧光标记探针在退火时均会与目标序列互补结合。Taq酶在延模板链延伸时遇到与模板稳定结合的探针，Taq酶的5’外切核酸酶会将与模板结合的特异探针降解，从而使探针上的荧光基团因为物理空间分离，淬灭效应消失，发出荧光。如果荧光探针与目标序列存在错配，就会大大减少荧光的释放量。后续通过软件分析处理荧光数据而确定基因型。

TaqMan-MGB探针技术是在TaqMan法基础上优化而成的一个SNP检测方法。该探针的3’端结合了小沟结合物（minor groove binder，MGB），MGB与DNA螺旋的小沟（minor groove）契合，通过稳定DNA双螺旋结构来提高杂交的准确性和稳定性。这使得探针长度进一步缩短，Tm值较高，增加了探针的杂交稳定性，使结果更准确。该探针结合的为非荧光淬灭基团，这可大大降低荧光本底，提高反应灵敏度。

TaqMan探针及TaqMan-MGB检测SNP基因型主要包括以下步骤：SNP位点（即基因序列）查找，DNA样品制备，引物探针设计，PCR反应液配制，上机检测，基因分型。引物设计除满足一般设计要求外，还应尽可能靠近探针，以探针的5’末端距离引物的3’末端一个碱基为佳。扩增产物长度不能过大，一般为100～150bp为宜。较短的扩增片段有利于保证分析的一致性。同时，要避免引物和探针形成二聚体或发卡结构。

TaqMan探针设计原则：①待测位点最好位于探针中间，尽可能靠近5’端；②探针长度为15～45个碱基，以20～30个为佳；③探针Tm值在65～70℃，比引物Tm值高5～10℃；④GC含量在40%～70%，这可保证探针退火先于引物与靶序列结合；⑤避免一连串的碱基重复序列及碱基G位于探针5’末端，因为5’G有淬灭作用；⑥探针中碱基C含量要大于G含量，因为G含量高会降低反应效率，如果G含量更高，就应选择其互补链作为探针。

MGB探针设计原则：①MGB探针设计在TaqMan探针设计基础上，应避免出现4个及4个以上的G重复片段；②探针设计应使SNP位点处于探针中间1/3范围内；③尽量缩短MGB探针长度，但不少于13个碱基。

TaqMan探针技术要求引物和探针要避光保存；检测时应以水为模板设置阴性对照，以已知基因型DNA为模板进行扩增作为阳性对照。TaqMan探针技术全程闭管操作，不需PCR后处理，不需凝胶电泳，操作简单，减少了PCR污染的可能性。该技术不需分离或洗脱等PCR后处理步骤，因此显著提高了检测速度。单管实现检测基因型，判读简单，通量高。该方法的不足在于TaqMan探针具有较高的荧光背景，而且探针仅有一个检测的差异，检测结果可能会出现假阳性。MGB这类非荧光淬灭基团的应用，降低了荧光背景，同时提高了Tm值，使SNP分型成功率进一步提升。

分子信标是一种内部有部分序列互补的U型单链寡核苷酸检测探针，在其两端分别标记淬灭基团和荧光基团。当其与目标序列完全互补时，U型探针打开，使得荧光基团和淬灭基团分离而产生荧光，反之，则没有荧光产生。探针由一段包含茎-环结构的单链寡核苷酸组成，其5’端和3’端部分碱基互补配对，形成探针的“茎”；5’端和3’端分别带有荧光基团和淬灭基团。中间“环”状序列与目标DNA序列互补。每检测一个SNP需要设计一对分子信标探针，其环状序列的中间碱基不同，分别对应SNP不同基因型。在未杂交状态时，探针以发卡结构存在，两个末端靠近，两基团之间发生荧光能量共振，不产生荧光。当分子信标和目标序列之间完全互补并形成稳定的双链结构，探针的茎环结构打开，荧光基团和淬灭基团分开，进而发出荧光。若探针与目标DNA序列存在错配碱基，就会影响探针与DNA序列结合，探针维持茎环结构，不发出荧光。

分子信标探针检测SNP基因型与TaqMan探针基本步骤相同，不再赘述。分子信标探针和引物设计有以下原则：①环状区序列一般为15～30个碱基，能与目标分子特异结合，达到识别的目的，通过调整环状区序列长度使其与DNA模板的变性温度比PCR的退火温度高7～10℃；②茎状区通常长度为5～8个碱基的互补序列，综合考虑长度、序列和GC含量，是其变性温度比PCR退火温度高7～10℃；③避免引物与探针之间存在连续的互补碱基，减少由此造成的非特异扩增；④引物扩增产物尽可能短，控制在150bp以内，提高检测灵敏度。

分子信标探针设计是实验成败的关键，在此基础上发展起来了多种新形式的分子信标，包括蝎形引物（scorpion primer）分子信标探针、锁核酸（locked nucleic acid，LNA）分子信标、肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）分子信标等。这些方法都是以等位基因杂交和荧光共振为基础，通过改变引物、探针的长度或进行特殊修饰，使其最终表现出荧光差异，达到判断SNP基因型的目的。这些新分子信标是TaqMan或普通分子信标的有效补充，为前述方法不能区分基因型的SNP提供了新的解决途径。

分子信标探针技术通过在单管中加入不同荧光标记的探针，可以实现单管分析同一SNP的不同基因型，提高了检测效率，降低了检测成本。而且该方法操作简单，一个反应完成，不需后续开管操作，避免了污染，也可实现自动化。同时核酸探针杂交具有高特异性，由于茎环结构的存在有效降低了反应中的背景荧光，提高了检测灵敏度。该方法的不足在于：引物探针设计要求高，过程烦琐，优化困难；并且标记探针昂贵，通用度低。

高分辨率溶解曲线（high resolution melt，HRM）实施的基础是不同核酸分子物理性质的差异，通过实时跟踪、收集升温过程中饱和荧光染料与PCR产物结合的信息，并进行软件分析形成溶解曲线。温度低时，染料结合牢固，荧光信号强；升高温度，DNA双链解开，荧光染料随之解离，荧光强度减弱。当温度达到Tm值，50%的双链DNA解成单链，荧光信号强度达到最低。PCR扩增的溶解曲线取决于其扩增序列，序列中一个碱基的差异都可导致双链的解链温度发生变化。通过专业软件分析这种变化即可判断SNP的基因型。

常规实时PCR使用的是不饱和SYBR Green染料，由于这种染料对PCR有抑制作用，所以使用浓度必须远低于使DNA双螺旋结构中小沟饱和的浓度。该技术难以保证染料与所有PCR产物结合，影响了检测的分辨率。目前HRM使用的是一类与DNA结合能力更强和对PCR抑制作用更小的饱和染料，如Eva Green、LC Green、SYTO9等。因为饱和染料的使用，大大提高了HRM在单碱基突变、小片段插入/缺失方面检测的灵敏度和分辨率。HRM技术对实验仪器的温度分辨率要求相当高，需达到0.02～0.1℃，每升高1℃采集荧光25次，以满足对单碱基差异的区分。HRM对温度均一性同样要求较高，一般PCR两孔间温差在0.3～0.5℃。这就导致两孔间最终溶解温度相差较大，无法保证HRM分析结果的准确性。

HRM操作简便，不需探针就可快速确认SNP基因型，费用低、速度快、通量高。闭管操作，不需要处理PCR后处理，减少污染可能性。同时，该法还可用于短片段重复序列的分析。其局限性在于对于仪器的灵敏度和分辨率要求较高，并且不能检测出待测核酸中新出现的变异位点。

限制性内切片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析是一种基于PCR扩增和限制性内切酶特异识别序列并切割的基因分型法。该法不依赖自动化设备，是实验室对较少量的标本进行基因分型的实用方法。限制性内切酶通常可以特异性识别双链DNA的某一段序列，并在特定位置或附近进行DNA双链切割，进而产生短的DNA片段。而由于限制性内切酶识别序列的严格性，识别序列发生一个碱基的变化都使得酶切位点不能被酶切，从而保持原有序列长度。

RFLP法用于基因分型时，限制性内切酶的识别序列选择主要依据SNP位点上的已知等位基因，根据待测的SNP等位基因和位点附近序列，查找符合序列的限制性内切酶。设计引物扩增含有SNP位点的DNA片段。当限制性酶与PCR产物共同孵育时，该酶将仅识别一个等位基因（野生型或变异型），然后在该位点切割DNA分子。依据个体携带的等位基因不同，酶切可以产生不同的切割片段，应用凝胶电泳，通过DNA片段大小判断SNP基因型。

RFLP基因分型法不需要探针标记，也不需要特别的仪器设备等，只需要找到特异性限制性内切酶，所以检测成本低，实验操作简单，常规实验室即可完成。但是该法包括PCR、酶切、电泳步骤，耗费人力多、时间长，难以实现高通量基因分型，只适合小规模的基因分型。而且，并非所有SNP位点均能找到合适的限制性内切酶，所以该法不能适用于所有SNP位点分型。

基因芯片（gene chip）又称为DNA微阵列（DNA microarray）或DNA芯片（DNA chip）。基因芯片技术实际上是一种大规模集成的固相杂交技术，即在固相支持物上原位合成寡核苷酸或直接将多种预先制备的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交。通过杂交样品的检测分析，进行基因分型。常见的基因芯片可分为两大类：一类是原位合成，另一类是合成后交联（直接点样）。原位合成适合寡核苷酸，直接点样多用于大片段DNA，有时也用于寡核苷酸。

用于SNP分型的基因芯片原理也建立在前述几种方法基础上，包括等位基因特异性杂交、单碱基延伸等。其应用实现了检测的集成化、高通量化。目前常用的用于SNP分型的DNA芯片主要包括以下两种：

等位基因特异性寡核苷酸（allele-specific oligonucleotide，ASO），由于没有酶的介入，杂交是最简单的SNP分型方法之一。将待测的靶DNA固定于固相支持物上，设计两种标记荧光的寡核苷酸探针，分别与被检测区野生/突变的DNA序列互补，在高度严格的杂交和洗脱条件下，只有完全匹配才能稳定杂交，只要有一个碱基不匹配，就不能形成稳定的杂交体。通过荧光信号的有无和种类则能对SNP进行检测。该技术的关键就是如何优化适合每个SNP的严格杂交和洗脱条件，以保证探针杂交的特异性。这一问题也限制了该方法的适用范围。

基于单碱基延伸（SBE）的SNP芯片又称固相微测序，详细原理可参见前述3种固相微测序技术。与ASO方法相比，DNA聚合酶的特异性是固相微测序具有更高的灵敏度和分辨率。目前已经获得国家食品药品监督管理局（State Food and Drug Administration，SFDA）批准的基因芯片，检测基因和位点均很少。而制订较全面的精准医学药物治疗方案，需要依据较全面的基因位点信息。要满足这一临床实际需求，基因芯片还有较长的道路要走。

连接酶检测SNP技术是建立在DNA连接酶对单个核苷酸的高度识别能力基础上的，它可以将两个与模板完全匹配的相邻寡核苷酸片段连接起来。如果连接处出现一个与模板不匹配碱基，连接反应就不能完成。反应体系中包含3种探针，其中一对探针是位于SNP位点上游的特异性等位基因探针，其3’端位于SNP位点上，分别对应SNP的两种基因型。另一个探针位于SNP下游，其5’端碱基为SNP下游第一个碱基。当探针与目的序列结合后，上游等位基因特异性探针的3’端与下游探针5’端紧邻，成缺口状。此时，若上游特异性探针3’末端碱基与模板互补，DNA连接酶识别后，催化上游探针3’羟基与下游探针5’端磷酸基，形成磷酸二酯键，填平缺口，两条探针连接为一条链。若上游探针3’末端碱基与模板不互补，则连接反应不能进行。

等位基因特异性探针可以设计为不同长度，通过电泳检测，或进行不同荧光标记，采用荧光检测技术检测。连接酶反应具有快速、高通量、高特异性、检测费用低等特点。

滚环扩增技术（rolling circle amplification，RCA）是1998年建立起来的一种基于连接酶连接、引物延伸与链置换扩增反应的一种等温核酸扩增方法。RCA利用滚环扩增检测SNP，首先需要设计一对针对SNP位点的锁式探针（padlock），锁式探针的两端与SNP位点附近序列互补。当有错配存在时，探针的连接反应就无法完成。RCA具有特异性高、操作简单等特点。

核酸入侵技术（invader assay）是建立在酶特异识别切割基础上的基因分型方法。它是由美国Third Wave Technology公司发展并注册商标的一种基因恒温探针扩增的核酸检测技术。其原理是通过一对寡核苷酸与目标序列杂交形成的特异性三股螺旋结构被切割酶识别并剪切而实现基因分型。

Invader反应体系包括两种探针：一种是Invader寡核苷酸，位于SNP位点的上游，与目标序列互补，3’端的碱基与SNP位点重叠；另一种探针是位于SNP下游的等位基因特异性寡聚核苷酸序列，包含与SNP位点的等位基因互补的核苷酸，5’端包含一段不与模板互补的尾序列（flap）。当两种探针与模板杂交时，形成特殊的交叠三股DNA螺旋结构，重叠点位于SNP碱基上。从古细菌分离出的热稳定瓣内切酶（flap endonucleases，FEN）能识别这种特殊结构并将其剪切，释放出等位基因特异探针的5’ flap。如果等位基因特异性探针与模板不匹配，则不能形成特殊三螺旋结构，就不能被FEN识别，不会发生剪切。在等位基因特异探针5’ flap端标记不同的荧光染料，被切除的5’端尾序列带着等位基因特异性荧光标记，切除后与淬灭基团分离，发出荧光被检测。