肺癌是全球范围内发病率和死亡率最高的癌症，2018年预计有210万新的肺癌病例和180万人死亡，分别占世界总癌症发病数及死亡数的11.6%和18.4%。肺癌患者的高死亡率与早期诊断准确性低和高复发率有关。目前，肺癌的早期诊断主要依赖低剂量CT和组织活检。低剂量CT假阳性率较高，且重复进行影像学检测，使患者多次暴露于电离辐射，增加了其患病风险，组织活检因其侵入性同样会对患者造成风险。此外，由于肿瘤有异质性，局部组织取样的基因分析可能不能准确地反映肿瘤完整的遗传信息，影响对患者的个性化治疗效果。

近年来，液体活检技术发展迅速，其中，循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）检测有着无创、简便、可以反映肿瘤基因全貌等优点，受到人们的广泛关注。人体内代谢凋亡的细胞会释放DNA进入血液循环系统，这种存在于血液、尿液、脑脊液等体液中的DNA被称作循环游离DNA（circulating free DNA，cfDNA）。对于癌症患者而言，肿瘤组织会释放循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）进入血液，并携带存在特异性遗传或表观遗传改变的DNA，这种DNA即为ctDNA。其在肺癌中的诊断、治疗及预后评估均有着很强的应用潜力。本文就肺癌中ctDNA的常用检测方法、检测内容、临床应用前景与面临的挑战进行综述。

在过去的几十年中，有许多方法可以检测肿瘤组织的遗传改变，如桑格测序、焦磷酸测序、实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）等。然而因为ctDNA本身质量极小，含量低，且ctDNA与正常DNA片段差异很小，藏匿在正常DNA片段中难以辨别，因此ctDNA的检测需要更高灵敏度和特异性的检测方法。近年来，新的方法如数字PCR（digital-PCR，dPCR），基于扩增受阻突变体系（amplification refractory mutation system，ARMS）的PCR技术（ARMS-PCR）、基于DNA序列的检测方法，高通量测序（High-throughput sequencing）或称下一代测序（next-generation sequencing，NGS）技术逐渐应用于ctDNA的检测。dPCR又称第三代PCR，主要的检测方法包括数字PCR-流式技术即BEAMing技术（包含小珠（bead）、乳浊液（emulsion）、扩增（amplification）、磁性（magnetic）四个主要组分）以及液滴数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）技术。dPCR成本低，灵敏度、特异性高，适合检测血液中的微量DNA，但只能检测已知突变。ARMS-PCR通过针对不同的已知突变，设计适当的引物区别突变型和野生型基因，具有高特异性、灵敏度、检测时间短、成本低等优点。基于DNA序列的检测方法可以检测未知突变，最常用的检测方法包括标记扩增深度测序法（tagged-amplicon deep sequencing，TAM-Seq）和深度测序肿瘤个体化建档法（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-Seq）。NGS包含全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）、全外显子组测序（whole-exome sequencing，WES）和目标区域测序（targeted region sequencing，TRS）等，其中WGS可以获得肿瘤的完整基因图谱，包括点突变、插入、缺失、重排和拷贝数异常，WES提供基因组所有编码碱基的信息，TRS可通过定制目标基因组区域的探针，与基因组DNA杂交，将目标区域DNA富集后进行高通量测序。但NGS技术需要对大量DNA模板初始分子进行拷贝以放大信号，因此很难实现精确追踪模板初始分子数，对精确定量造成了困扰，且价格昂贵，难以广泛应用于临床。Kivioja T等开发了一种对初始分子进行特殊的人工标记（UMIs）的新方法，这种方法可以精确追踪模板初始分子数，从而增加了NGS的灵敏度和特异性。

肺癌中比较常见的基因点突变常发生于EGFR、KRAS、BRAF等基因上。当ctDNA应用于检测肺癌患者的基因突变时，需要考虑其能否反映肿瘤组织的基因突变。ctDNA中的点突变检测以EGFR为主。Douillard JY等使用ARMS对652人的肿瘤组织和血浆样本进行比较分析，发现EGFR突变状态可以通过ctDNA精确评估，表现出了ctDNA检测的高敏感性（65.7%）和高特异性（99.8%），组织与血浆的突变状态检测的一致性为94.3%。Yang M等对5例接受酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKI）治疗的患者采用纵向ctDNA抽样的方式进行监测，发现ctDNA突变变化与药物疗效一致。在使用EGFR靶向药后，可能会产生T790M突变致使产生耐药性。Oxnard GR等使用BEAMing检测ctDNA的EGFR ^T790M突变，其灵敏度为70%，ctDNA阳性结果的患者可避免进行T790M基因分型的肿瘤活检，但由于血浆检测的假阴性率为30%，因此血浆阴性的患者仍需要进行肿瘤活检来确定T790M是否存在。Passiglia F等对21项基于血浆的EGFR ^T790M突变检测的研究进行了meta分析，其总体的合并敏感性和特异性分别为0.67（95%CI 0.64～0.70）和0.80（95%CI 0.77～0.83），说明ctDNA分析是一种有前途的检测NSCLC患者T790M突变的方法。BRAF，TKIs和其他下游抑制剂（MEK）联合应用于BRAF突变的NSCLC肺癌患者的最新证据，为这些患者的一线治疗引入了一种新的治疗方案，有必要将BRAF突变检测（尤其是V600E突变）纳入NSCLC肺癌患者的检查中。

肺癌中常见的基因重排有ALK及ROS1基因重排。目前已有克唑替尼、阿来替尼、色瑞替尼、布加替尼等多种ALK抑制剂用于临床。ALK基因重排检测对治疗选择至关重要。在关于ROS1基因重排的研究中，Shaw AT等发现ROS1阳性的NSCLC患者对克唑替尼的应答率为72%，标志着ROS1融合基因可以作为一个独立的分子预测生物标志物预测克唑替尼疗效，已被NCCN指南推荐。传统的基因融合检测技术有荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）、基于PCR扩增技术、免疫组织化学法（immunohistochemistry，IHC）等，但受限于只能通过肿瘤组织切片或细胞学标本检测。近来，NGS技术快速发展，其不仅可以检测组织样本，而且可以检测血浆和胸水样本中的基因重排，而且灵敏度也远高于目前传统检测技术，可以检出0.1%以下的基因融合。

DNA甲基化是在DNA甲基酶催化下，将甲基基团添加入DNA分子的碱基上，这个过程通常发生于胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（cytosine phosphate guanine，CpG）二核苷酸中胞嘧啶的碳-5位置，形成5-甲基胞嘧啶（5mC）。在正常组织中，大部分散落的CpG是被甲基化的，但一部分序列含有高富集的CpG，称为CpG岛（CPG islands，CGIs），其主要位于基因的启动子和第一外显子区域，往往是非甲基化的。因此，DNA甲基化的异常包含CGIs的高甲基化及重复序列的低甲基化。目前，甲基化的检测主要使用荧光定量甲基化特异性PCR（quantitative methylation specific PCR，qMSP）技术。

肺癌的发生、发展、耐药、预后均伴随着DNA甲基化异常的变化。与肺癌相关的甲基化异常位点众多，其中，应用较多的有SHOX2和RAS相关家族1A（RASSF1A）等，但目前仍未有一个高特异性和敏感性的位点，研究中常用几个位点进行联合检测以获得较好的结果。

随着液体活检技术的发展，DNA甲基化的检测也不仅限于组织样本中。Ooki A等检测了IA期NSCLC患者的血清、胸腔积液和腹水样本中的DNA甲基化，在癌症基因图谱（TCGA）数据集中筛选了6个基因（CDO1、HOXA9、AJAP1、PTGDR、UNCX、MARCH11）作为一个基因面板，其敏感性为72.1%（31/41），特异性为71.4%（30/42）。Wang J等从GEO中，能将mRNA表达下调与6个基因（ABCA3、COX7A1、HOXA5、SLIT3、SOX17和SPARCL1）的DNA超甲基化联系起来。6个基因的功能分析表明，这些基因主要富集于癌相关通路，可能通过调节上皮间充质转化过程促进癌变。Hulbert A等检测了ⅠA、ⅡA期NSCLC患者的血浆及痰液中的DNA甲基化，有5个基因在癌症患者血浆和痰中检测到DNA甲基化的频率更高（ P< 0.001）。最佳单个基因的三基因组合使用痰诊断肺癌的敏感性和特异性分别为98%和71%，使用血浆诊断的敏感性和特异性分别为93%和62%。

此外，DNA甲基化异常可能与肺癌的致病因素相关，如吸烟、空气污染、石棉等。

微卫星DNA（microsatellite DNA），又称短串联重复序列（Short Tandem Repeat，STR），通常存在于内含子等非编码区，其由于重复单位的插入或缺失引起的长度的改变即称微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI），可用于肺癌的辅助检测。自从在cfDNA中发现了微卫星的改变，因其有微创、安全等优点，因此受到人们的广泛关注。微卫星改变的定位可以通过比较基因组杂交（comparative genomic hybridization，CGH）技术实现。Sozzi G等对87例非小细胞肺癌患者的肿瘤组织及血浆进行检测，发现血浆中有与原发肿瘤完全相同的MSI改变，使用位于D21S1245上的2个微卫星位点检测了87例NSCLC患者的肿瘤组织及血浆，结果49例肿瘤组织中MSI阳性，而对应的血浆中有35例MSI阳性；更有意义的是有43%的临床Ⅰ期及45%的肿瘤最大直径小于2cm的患者血浆中也检测到MSI阳性，为NSCLC的早期诊断又提供了一条新的途径。Merlo等对33例SCLC行MSI检测，结果45%的患者表现为MSI，Chen等对21例SCLC患者的肿瘤组织及血浆分别作MSI检测，发现76%的肿瘤组织MSI阳性，血浆中的阳性率也达到了71%，都说明MSI与SCLC密切相关。肺鳞癌患者血液中微卫星DNA异常率高达76.7%，提示微卫星DNA作为肺鳞癌的早期诊断标记物具有很高的特异性。此外，联合检测p16甲基化与MSI，可以显著提高早期肺癌诊断的敏感性同时不降低其特异性。

肿瘤突变负荷（tumor mutation Burden，TMB），定义为肿瘤组织每兆碱基体细胞碱基替换及插入缺失突变的突变总数，或者可以说是肿瘤基因的突变密度，可使用NGS进行检测。TMB高代表肿瘤中基因突变多，更易对免疫治疗发生响应。TMB通常促使细胞产生更高的新抗原负荷，因此，能够刺激免疫反应的抗原在肿瘤细胞表面表达，并被细胞毒性T细胞识别的几率更高。Boumber报道TMB与NSCLC患者的派姆单抗疗效密切相关。Hellmann MD等报告纳武单抗+派姆单抗联合，在高TMB患者中1年总生存率为62%。低/中TMB患者为20%～26%。约有30%的患者无法进行标准的组织NGS检测，这时非侵入性的血检是一个非常好的替代手段。Gandara DR在 Nature Medicine发表首个血液TMB（blood TMB）的验证性文章，证实其对免疫治疗药物疗效预测的有效性，bTMB高于16的患者可以显著从阿特朱单抗中获益，患者组织样本与治疗前血液样本的TMB结果阳性一致为64%，阴性一致率为88%。

化疗和靶向治疗药物在一定程度上可以控制肿瘤生长，但是使用一段时间后，肿瘤常常会产生抗药性，使得药物治疗失败。这个过程中一个重要的机制就是肿瘤有异质性（intratumoral heterogeneity，ITH）。Gerlinger等在对多个区域的组织样本进行测序后，证实了肿瘤内的异质性，即同一患者不同区域突变谱存在明显差异，且原发灶和转移灶突变谱也存在明显差异。de Bruin EC等在肺癌中也发现了相似的现象。异质性的产生是因为同一个肿瘤是由具有多种不同基因组特征细胞构成，每一种细胞构成一个亚克隆，亚克隆呈现出分子生物学或基因方面的异质性，从而使肿瘤的生长速度、侵袭能力、对药物的敏感性、预后等各方面产生差异。Jamal-Hanjani等对100例在系统治疗前切除的早期NSCLC肿瘤的327个区域进行了全外显子组测序，评估肿瘤内异质性与无复发生存期之间的关系，观察到了75%以上的肿瘤中均有异质性基因改变，因此从单个肿瘤活检样本难以窥探肿瘤基因的完整图景，可能对临床靶向药物的选择和疗效的预估造成挑战。相比之下，ctDNA源于全身肿瘤细胞，在遗传和表观遗传方面保持着肿瘤的异质性。Abbosh C等发现可以通过ctDNA追踪肺癌中复发和转移的亚克隆，探究了ctDNA在肿瘤系统内早期识别非小细胞肺癌复发和转移的能力，为限制肿瘤复发提供新的治疗方法，为ctDNA应用于肺癌的治疗研究开辟了新的途径。

Merker等对77篇在实体肿瘤中ctDNA检测的应用文献进行了总结，证明了在晚期肺癌中ctDNA检测的临床有效性和实用性，一种基于PCR对NSCLC患者EGFR突变的ctDNA检测方法已在美国和欧洲获得监管机构批准。但是目前缺乏前瞻性实验数据证明ctDNA检测在肺癌早期癌症筛查、治疗监测等应用中的临床应用价值和临床有效性。

ctDNA检测本身有其局限性。ctDNA浓度比较低，对检测技术的灵敏度要求较高。随着检测技术的发展，检测肿瘤特异性遗传改变和表观遗传改变的技术的灵敏度提高了，但因灵敏度提升而对浓度较低样本进行测试时，肿瘤相关的DNA突变和非肿瘤相关的DNA突变变得更加难以区分，从而增加了假阳性的风险。所以低水平的ctDNA仍然是限制ctDNA在肺癌中应用的主要因素，因此开发从cfDNA中富集ctDNA的技术依然需要研究者们的共同努力。此外，目前能够证明ctDNA检测的临床实用性的前瞻性实验也较为缺乏。首先是早期前瞻性数据的缺失，较早的实验估计有20%对TKI耐药的NSCLC的活检样本缺失。尽管一些实验已证明，在血浆中测得EGFR突变的NSCLC患者与组织样本中测得突变的患者对TKI的反应一样好，但这些研究都排除了无法获得肿瘤组织基因分型的患者。其次，大多数试验选择入组肿瘤组织基因分型阳性的患者，因此，血浆突变阳性的病例往往为血浆、组织突变双阳性，这并不代表ctDNA检测的临床应用前景。一项针对NSCLC患者的奥希替尼临床试验中，发现其中有18例患者，在血浆中检测到EGFR T790M突变阳性而在肿瘤组织中检测为阴性，这些患者对奥希替尼的反应不如在肿瘤组织中检测到T790M的患者。到目前为止，还很少有前瞻性试验能仅根据ctDNA检测结果预测靶向治疗的疗效。

ctDNA检测是一个很有前途的研究领域，它可以用来检测循环系统中肿瘤特异性的分子改变。ctDNA检测的关键优点在于高度的特异性。ctDNA只来源于肿瘤细胞，而不来源于正常细胞。ctDNA的分子检测体现了ctDNA有别于cfDNA的特异性改变。至于检测的敏感性，虽然在早期肺癌中检测比较困难，但在晚期肺癌中，ctDNA水平丰富，且相对于组织活检，ctDNA检测更加安全无创，能够更加全面的解读基因的异质性避免偏倚。而且，随着富集技术的进步，ctDNA可以更好地应用于肺癌的筛查和治疗。