最新进展
第二节 尿液脱落细胞学研究进展
目前对有临床症状的可疑患者，如全程无痛肉眼血尿者，或已确诊尿路上皮癌患者术后随访时，针对尿液标本的主要检测方法包括尿液脱落细胞学及分子标志物检测。
一、尿液脱落细胞学检测
正常尿液标本中可见尿路上皮细胞、鳞状上皮细胞及炎症细胞等，最具诊断意义的是尿路上皮细胞及鳞状上皮细胞，其中鳞状上皮细胞常来源于尿路上皮细胞的鳞状化生及外生殖道皮肤。尿液脱落细胞中常见的恶性肿瘤是尿路上皮癌，按细胞恶性程度又分为低级别尿路上皮癌和高级别尿路上皮癌。
尿液脱落细胞学检测主要通过对尿液细胞进行富集，在显微镜下查找异型细胞，但由于受到脱落细胞数量及退变等因素的限制，细胞病理医师只能通过少量单个或小巢团细胞做出诊断，导致尿液脱落细胞学诊断的准确性降低，而且对于低级别和高级别尿路上皮癌诊断的准确率相差较大（前者较后者不易诊断），这也造成尿液脱落细胞学诊断的敏感性偏低。在低级别尿路上皮癌中，细胞学诊断的难点在于脱落细胞团退变，并且容易缺少血管纤维轴心这一关键证据。在高级别尿路上皮癌中，由于肿瘤细胞黏附性较差，在尿液中常可查见较多散在异型的肿瘤细胞，其诊断率较高，且重复性和一致性较好。文献报道尿液脱落细胞学诊断在高级别尿路上皮癌中的敏感性约为90%［1］。高级别尿路上皮癌患者复发的风险显著高于低级别尿路上皮癌。因此，尿液脱落细胞的富集及诊断在临床高级别尿路上皮癌患者中具有重要的应用价值。
目前，常用的尿液脱落细胞学诊断标准为巴黎报告系统（the Paris system，TPS）。该系统最早在2013年由细胞病理学专家、临床病理学专家及泌尿外科医师共同提出，主要是关于尿液脱落细胞学的规范化诊断标准。该系统对于高级别尿路上皮癌的诊断价值较大。TPS诊断标准进一步降低了可疑非典型细胞病例的诊断比例，并且提出联合分子检测的必要性。
二、尿液脱落细胞分子标志物检测
在肿瘤发生发展的过程中，肿瘤细胞的基因组学改变要早于细胞形态学变化。对细胞学无法确定的非典型尿路上皮细胞及低级别尿路上皮癌的诊断，一直是研究的难点。随着对基因层面研究的深入以及分子检测技术的发展，肿瘤的精准化诊断得以实现。为提高尿液脱落细胞标本的诊断率，目前美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）已批准了几种可用于尿路上皮癌检测的分子标志物技术，包括膀胱肿瘤抗原（bladder tumor antigen，BTA）检测、核基质蛋白22（nuclear matrix protein 22，NMP22）检测、细胞免疫荧光检测、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技术、CxBladder检测及纤维蛋白（原）降解产物（fibrin or fibrinogen degradation product，FDP）检测。基于尿液标本简便易得，且具有早期诊断、协助尿液细胞学诊断及随访的潜在应用价值，尿液脱落细胞分子标志物的研究吸引了大批学者关注，近年来涌现出许多新的发现。
（一）BTA检测
BTA是一种由特异多肽构成的高分子复合物（人补体因子H相关蛋白），是膀胱癌细胞基底膜被蛋白水解酶降解后的产物，包括糖蛋白、蛋白多糖及胶原片段等。利用单克隆抗体检测尿液中BTA的表达，包括两种方法：BTA Stat法及BTA Trak法。BTA Stat法是一种定性检测方法，主要利用胶体金免疫层析法进行快速检测，其敏感性和特异性分别为57%和68%，比尿液细胞学检测的敏感性高，但特异性低［2］。BTA Trak法是一种定量检测方法，主要利用酶联免疫法检测新鲜的尿液标本，其敏感性和特异性分别为66%和65%［3］。BTA检测对于尿路上皮癌检测的敏感性高于细胞学，尤其是对于非肌层浸润性膀胱癌具有较高的敏感性，但也存在假阳性的风险，假阳性主要发生在泌尿系统结石、感染及接受泌尿系统器械操作的患者，因这些病变或操作常引起血尿，进而导致检测假阳性率的提高。
（二）NMP22检测
NMP是一种以细胞核核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）-蛋白质为结构骨架的三维网状结构蛋白，可用于维持细胞核的形态，参与脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）复制、RNA转录及基因表达的调控［4］。正常尿液中NMP22含量较低，细胞死亡时以可溶性复合物或片段形式释放NMP22，在尿路上皮癌患者尿液中该蛋白浓度水平可提高5倍［5］。NMP22检测包括两种方法，一种为定量的酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），采用双抗体夹层免疫酶标法测定吸光度，通过建立标准曲线，检测尿液中NMP22蛋白的浓度；另一种为定性的NMP22 BladderChek法，是一种快速、简单的方法。研究报道NMP22检测的敏感性和特异性分别为65%和81%［6］。NMP22检测可用于尿路上皮癌的辅助诊断及术后随访，且随着病理分级增加其检测的准确性增高，对于低级别尿路上皮癌的诊断率不高。同BTA法，在泌尿系统结石、感染及接受泌尿系统器械操作等患者的尿液检测中也会有假阳性发生。
（三）免疫荧光检测
尿液免疫荧光检测是一种较敏感的检测方法，该方法主要应用3种抗体（LDQ10、M344和19A211）分别检测尿液脱落肿瘤细胞中的黏蛋白样抗原和癌胚抗原。免疫荧光检测同尿液脱落细胞学联合使用，可提高尿路上皮癌的诊断率。文献报道免疫荧光检测的敏感性和特异性分别为84%和75%，尤其在低级别尿路上皮癌中的敏感性优于尿液脱落细胞学［6］。同其他技术比较，免疫荧光检测受血尿或泌尿系统感染的影响较小，但特异性较低，而且因尿液标本稳定性差，结果判读受人为主观因素影响较大，限制了其在临床中的广泛应用。
（四）FISH技术
FISH技术应用荧光染料标记寡核苷酸片段作为探针，经过变性、退火，按照碱基互补配对原则，荧光探针与目的片段杂交，最后在荧光显微镜下观察细胞核内荧光信号的表达情况，从而对染色体数目和结构进行分析。遗传学研究表明恶性肿瘤的发生常伴有染色体的异常，在尿路上皮癌中最常见的染色体异常包括：3号、7号及17号染色体非整倍体改变及9号染色体9p21 缺失。FISH法检测尿液脱落肿瘤细胞的敏感性为82.5%～94.3%，特异性为81.3%～100%［7-8］。与尿液脱落细胞学相比，FISH检测的敏感性较高，特异性相似。对于尿液脱落细胞学诊断为可疑或非典型性细胞改变的病例，联合FISH法可提高诊断的准确性，且对尿路上皮癌的早期筛查、诊断与复发监测有较高的临床应用价值。
（五）CxBladder检测
CxBladder检测是应用逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）技术检测尿液中脱落细胞信使RNA（messenger RNA，mRNA）的表达，该方法检测的mRNA包括4种肿瘤细胞标志物（IGFBP5、HOXA13、MDK及CDK1）及作为排除参照的炎症相关mRNA（CXCR2），以降低假阳性率。据报道CxBladder检测膀胱癌的敏感性和特异性分别为82%和85%［9］。该方法尤其适用于血尿标本，但对实验室检测环境要求较高。
（六）FDP检测
FDP是纤维蛋白或纤维蛋白原在纤溶酶作用下降解产物的总称。肿瘤细胞内产生的纤溶酶原激活物可与其表面相应的受体结合，从而激活纤溶酶，启动纤维溶解程序。FDP最终经尿液排出，与正常人相比，尿路上皮癌患者的尿液中会含有相对较多的FDP。研究报道FDP检测膀胱癌的敏感性和特异性分别为64%和77%［10］。
（七）其他进展
除上述美国FDA批准的检测方法外，研究学者还致力于开发其他的检测技术，主要集中在对循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）、循环肿瘤游离DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）、mRNA、微小RNA（microRNA，miRNA）及蛋白质、代谢物和细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）检测的研究。
液体活检是近年来研究的热点，主要包括CTC及游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）的检测。液体活检在早期筛查、初步诊断及术后随访方面具有广泛的临床应用价值。目前，液体活检研究主要采用血液标本，但对于尿路上皮肿瘤患者，尿液标本留取更为方便、无创，可对尿液肿瘤细胞进行基因检测。尿液检测主要涉及基因标志物，包括TERT、FGFR3、RAS等；DNA甲基化标志物，包括TWIST1、EOMES、HOXA9、POU4F2等；蛋白质标志物，包括Survivin、ANG、APOE、CA9、IL8、SDC1、MMP9、VEGFA［11～15］等。
应用高通量测序法、数字PCR法或质谱法等高通量或高灵敏技术检测尿路上皮癌易感基因，分析癌细胞中基因突变、缺失、插入或融合，进行多基因联合检测或多组学联合检测，将成为未来最具潜力的检测方法，可更加全面地认识肿瘤的发生、进展机制，为尿路上皮病变的诊断和药物治疗方案的制定提供重要依据。